Giải Luyện tập và vận dụng 3 trang 19 Chuyên đề Sinh học 12

Lời giải

## Phân tích đề

Đề cho hai enzyme có tính đặc hiệu ngược nhau:
- RNase A phân huỷ đặc hiệu RNA ⟹ trong quy trình tách RNA tuyệt đối không dùng RNase A, đồng thời phải ức chế mọi RNase tạp để bảo vệ RNA (RNA rất dễ bị phân huỷ).
- DNase I phân huỷ đặc hiệu DNA ⟹ dùng DNase I để loại bỏ DNA mà không ảnh hưởng tới RNA.

Đây chính là điểm khác biệt mấu chốt so với quy trình tách DNA đã học (khi tách DNA người ta mới dùng RNase A để loại RNA). Khung chung vẫn là: phá vỡ tế bào → loại bỏ DNA và protein → làm tủa → thu nhận.

## Quy trình tách chiết RNA đề xuất

Bước 1 – Phá vỡ tế bào, giải phóng acid nucleic: Nghiền mẫu mô/tế bào trong điều kiện lạnh (trên đá hoặc nitơ lỏng) với dung dịch đệm li giải chứa chất ức chế RNase (ví dụ guanidinium isothiocyanate, $\beta$-mercaptoethanol). Màng tế bào và màng bào quan bị phá vỡ, giải phóng RNA, DNA và protein vào dịch chiết; chất ức chế RNase bất hoạt RNase nội bào để bảo vệ RNA.

Bước 2 – Loại bỏ mảnh vụn tế bào: Li tâm tốc độ thấp ($500\text{–}1000\times g$), thu phần dịch nổi chứa RNA, DNA và protein hoà tan.

Bước 3 – Loại bỏ DNA bằng DNase I: Bổ sung DNase I, ủ ở $37^\circ\text{C}$ khoảng $30$ phút. DNase I cắt đặc hiệu DNA thành các đoạn nhỏ, còn RNA không bị ảnh hưởng. (Không dùng RNase A ở bước này.)

Bước 4 – Loại bỏ protein (và DNase I): Xử lí dịch chiết bằng hỗn hợp phenol : chloroform để biến tính, kết tủa protein. Li tâm phân lớp, thu pha nước phía trên chứa RNA hoà tan.

Bước 5 – Làm tủa và thu nhận RNA: Thêm ethanol (hoặc isopropanol) cùng muối vào pha nước để RNA kết tủa (RNA không tan trong cồn). Li tâm thu cặn RNA, rửa bằng ethanol $75\%$, để khô và hoà tan trong nước không có RNase (nước xử lí DEPC) để bảo quản, sử dụng.

## Kiểm chứng giả thuyết

Dựa trên chính tính đặc hiệu của hai enzyme, chia sản phẩm thu được để thử:

| Mẫu | Xử lí | Kết quả kì vọng | Ý nghĩa |
|------|--------|-----------------|----------|
| Đối chứng | Không xử lí | Giữ nguyên | Mẫu ban đầu |
| Thử 1 | Thêm RNase A | Sản phẩm bị phân huỷ | Xác nhận mẫu có RNA |
| Thử 2 | Thêm DNase I | Không thay đổi | Xác nhận đã loại hết DNA |

Ngoài ra có thể chạy điện di gel agarose: xuất hiện hai băng rRNA $28S$ và $18S$ rõ nét chứng tỏ RNA còn nguyên vẹn.

## Đối chiếu với internet

Tra cứu “Quy trình tách chiết RNA” cho thấy các quy trình thực tế (TRIzol, bộ kit RNeasy của Qiagen…) đều theo đúng logic trên: dùng guanidinium isothiocyanate để bất hoạt RNase ngay khi phá tế bào → có bước xử lí DNase I loại DNA tạp → kết tủa RNA bằng ethanol rồi rửa sạch. Như vậy quy trình đề xuất phù hợp với thực tiễn ⟹ giả thuyết được kiểm chứng (đpcm).

Đáp số